BioXplorer

В зависимости от поставленной задачи используются два типа векторов: замещающий и вставочный. Первый тип векторов позволяет заменить участок гена мишени, в то время как второй интегрирует в изучаемую последовательность. Строение обоих типов векторов одинаково, кроме ориентации фланкирующих последовательностей (рис. 2). Наиболее часто используются замещающие вектора.

Рис. 2. Два типа векторов – замещающий (А) и вставочный (Б) – и их механизмы интеграции в геном [5].

Вектор для трансформации несет клонированную последовательность изучаемого гена, с внесенными в нее необходимыми изменениями. Это может быть: внесение стоп-кодона, приводящее к синтезу короткого неактивного пептида; делеция одного или нескольких экзонов; делеция промоторной области; вставка, приводящая к нарушению нормального функционирования гена и любые другие изменения, приводящие к отсутствию функционального продукта изучаемого гена или значительно снижающие его активность. Также в эту последовательность вносится положительный селективный маркер (МПС), которым является ген neo. Продукт этого гена дает несущим его клеткам устойчивость к антибиотикам неомицину и канамицину. Модифицированная последовательность должна быть фланкирована неизмененными участками, по которым будет проходить рекомбинация. Эффективность рекомбинации зависит от длины фланкирующих последовательностей [22], что в свою очередь зависит от возможностей вектора (рис. 3). При длине гомологичного плеча около 5 тыс. п.н. процент рекомбинации составляет 0,001.

Рис. 3. Зависимость частоты интеграции вектора от длины гомологичных плеч [22].

В качестве вектора можно использовать бактериальные искусственные хромосомы (BAC), со вставками фрагментов генома мыши. В этом случае размер одного плеча может составлять до 150 тыс. п.н., а размер делеции до 25 тыс. п.н. Наилучший процент рекомбинации (8,3%) получен авторами с использованием длины плеча 110 тыс. п.н. [26].

Существует вероятность, что рекомбинация пройдет не по исследуемым нами участкам генома, а в любой другой сходной области. При этом ген neo (МПС) сохранится, и в отобранном пуле ЭСК будут присутствовать рекомбинантные клетки, не несущие необходимых изменений. Эта проблема решается внесением в векторную конструкцию маркера отрицательной селекции (МОС). Им может служить ген тимидин-киназы простого вируса герпеса (HSV-tk) или ген дифтерийного токсина А (DT-A), продукты которых убивают эукариотические клетки. Положение МОС с наружной стороны гомологичного плеча вектора позволяет элиминировать его после прохождения гомологичной рекомбинации (рис. 4). В случае же негомологичной рекомбинации, МОС оказывается интегрированным в геном трансформированной клетки, что приводит к ее элиминации. Наличие двух маркеров селекции (положительного и отрицательного) позволяет быстро и эффективно проводить отбор нужных трансформантов [23,19].

Другие статьи:

Гипотезы и теории происхождения жизни
С глубокой древности и до нашего времени было высказано бессчетное количество гипотез о происхождении жизни на Земле. В настоящее время существует 5 научных концепций возникновения жизни: 1. Возникновение живого из неживого, подчиняясь ...

Какими методами удалось изучить состав живой клетки и ее молекулярное строение? Каково значение неорганических компонентов клетки в обеспечении процессов ее жизнедеятельности?
Клетка – элементарная живая система. На нашей планете все живое развивалось в несколько миллионов видов, но все они от бактерий до высших живых – состоят из клеток. Об открытии клеточного строения жилого вещества сообщил в 1665 году Гук. ...

Понятие об осмотическом давлении. Осмотическое давление разных клеток и тканей растения
Когда раствор отделен от воды полупроницаемой мембраной, которая пропускает только растворитель и непроницаема для растворенных веществ, возникает односторонний ток воды по градиенту ее активности в направлении раствора. Этот процесс назы ...