Внесение вектора в эмбриональные стволовые клетки
Для трансформации используют эмбриональные стволовые клетки мышей. Помимо того, что культура ЭС клеток способна расти in vitro, при пересадке во взрослую мышь или эмбрион клетки имеют свойство приживаться. ЭС клетки, в отличие от специализированных соматических клеток, сохраняют генетические потенции без тканевой специализации. Эти клетки имеют "минимальный" фенотип: минимум рецепторов и программ для взаимодействия с микроокружением, поскольку лишь 5% из 500 генов транссигнализации экспрессировано в пролиферирующих ЭСК. Второй важнейшей характеристикой ЭСК в культуре является практически неограниченный потенциал пролиферации, обусловленный особенностями фенотипа незрелых клеток. Третьей особенностью ЭСК является рост суспензионными клонами без какой-либо примеси продвинутых клеток, прикрепленных к подложке. Каждый клон в такой культуре является производным одной прародительской ЭСК [1].
Эмбриональные стволовые клетки мыши впервые получены в 1981 году [8], что дало возможность для развития работ по инактивации генов. Внесение линеализированного вектора в ЭС клетки возможно несколькими методами: микроинъекция, трансфекция (электропорация), трансдукция (вирусная инфекция). Перечисленные методы имеют свои преимущества и недостатки.
Микроинъекция позволяет с частотой до 100 процентов вносить экзогенную ДНК в клетку, а частота гомологичной рекомбинации составляет около 0,67%. Этот метод, несомненно, является наиболее эффективным. Однако для осуществления микроинъекции требуется дорогое оборудование и высокая квалификация экспериментатора. Помимо этого, сам метод очень трудоемок и занимает много времени. Векторные конструкции микроинъекцией можно вносить и в зиготу, но отобрать нужные трансформанты в этом случае невозможно.
Наиболее экономичными и достаточно эффективными методами внесения экзогенной ДНК в клетку являются электропорация и ретровирусная инфекция. К их достоинствам, в первую очередь, следует отнести возможность одноразово обработать сотни тысяч клеток, которые благодаря системе позитивной-негативной селекции достаточно быстро проходят отбор. Это существенно упрощает и делает экономически выгодным, по сравнению с микроинъекцией, процедуру получения трансформированных клеток. Оба метода имеют свои недостатки: больший процент негомологичной рекомбинации при внесении векторных систем электропорацией по сравнению с другими методами, ограниченые размеры ретровирусных векторов и т.д. [21]. Наиболее часто внесение векторов в клетку проводят с помощью электропорации. В то же время ретровирусная инфекция позволяет вносить экзогенную ДНК не только в ЭС клетки, но и в эмбрионы. Итак, линия трансформированных клеток получена и поддерживается. Следующий этап – внесение клеток в эмбрион мыши (как правило, на стадии бластулы). Химерный зародыш подсаживают в матку ложно беременной самки. Полученную таким образом химеру скрещивают с нормальным, но имеющим отличия (например, цвет) животным. Если полученные в первом поколении мыши имеют фенотип линии, из которой получены ЭС клетки, то их можно использовать для насыщающего скрещивания. Результатом будет получение линии животных, гомозиготных по созданной мутации.
Другие статьи:
Australopithecus garhi
Найден в Эфиопии в 1997, описан в 1999. "Garhi" по-афарски значит "удивительный". Объем мозга - примерно 450 куб.см. Возраст - 2,5 млн. лет. Крупные коренные и предкоренные зубы сближают эту форму с парантропами (см. н ...
Исторические предпосылки возникновения учения Чарльза Дарвина
Общественно-экономические предпосылки.
В первой половине XIX в. Англия стала самой передовой капиталистической страной, с высоким уровнем развития промышленности и сельского хозяйства. За счет разорения мелких собственников земля сосредо ...
Эколого-этологические аспекты существования поливидовой колонии птиц
Состав поливидовой колонии птиц. В пределах колонии, как в центре, так и на периферии, среди гнезд озерной чайки располагаются гнезда или группы гнезд черношейной поганки. Для озерной чайки это объясняется стремлением построить свое гнезд ...