"Программируемый нокаут генов"
Следует отметить, что не все гены можно инактивировать на стадии зародыша. И, естественно, нельзя получить клетки или животных, нокаутированных по так называемым генам домашнего хозяйства. Однако для генов, принимающих участие в эмбриональном развитии, разработан подход, позволяющий проводить их инактивацию после развития организма. Данная стратегия позволяет "выключать" гены в определенных условиях ("программируемый нокаут генов", англ. conditional knockout), а именно в необходимой исследователю ткани или группе клеток и/или под воздействием индуцирующего вещества.
Это можно осуществить с помощью методики, сочетающей гомологичную рекомбинацию, как в случае классического нокаута генов, и системы сайт-специфической рекомбинации. Сайт-специфические рекомбиназы – это ферменты, узнающие особые участки ДНК и совершающие обмен между ними. Наиболее часто используются Cre рекомбиназа бактериофага P1 и Flp рекомбиназа (флипаза) дрожжей. Эти ферменты распознают нуклеотидные последовательности в 34 основания, называемые, соответственно, loxP и frt сайты [16]. Если эти последовательности расположены в одной ориентации, рекомбинация по ним приведет к делеции фланкированного участка. Если же ориентация последовательностей различна, то это приведет к инверсии фрагмента между ними (рис. 5).
Рис. 5. Схема механизма сайт-специфической рекомбинации. В зависимости от ориентации loxP-сайтов происходит либо делеция, либо инверсия фланкированого фрагмента [20].
Использование стратегии "программируемого нокаута гена" требует создания двух линий мышей. Линия А несет интегрированную в геном последовательность гена Cre под контролем ткане-специфичного или индуцибельного промотора. Линия В содержит два loxP сайта, фланкирующих подлежащую удалению последовательность исследуемого гена (экзон, промотор и т.д.) [25]. Следует отметить, что вставки в геномную последовательность loxP сайтов и гена Cre осуществляются с использованием тех же приемов, что и при классическом нокауте генов, но не должны затрагивать функциональные последовательности (рис. 6).
Рис. 6. Схема использования тканеспецифичной Cre-loxP рекомбинации для получения мышей с программируемым нокаутом гена [25].
Полученные таким образом гомозиготные линии мышей скрещивают. У потомков от этого скрещивания исследуемый ген будет инактивирован в ткани или группе клеток, где будет активен промотор, контролирующий активность гена Cre [25]. Используя стратегию "программируемой инактивации гена", можно добиться результатов, недоступных при использовании стандартной процедуры нокаута генов.
Другие статьи:
Выводы
1. Нейрологическая память обладает сложной системной организацией и не имеет строгой локализации в определенных участках мозга. По современным представлениям, следы памяти фиксируются в мозге в виде изменений состояния синаптического аппа ...
Методика исследования
В наших исследованиях был использован маршрутный метод учёта птиц.
Маршрутный учёт.
Последние десятилетия характеризуются бурной урбанизацией территории, ростом больших и малых городов, посёлков городского типа, других населенных пунктов ...
Водная среда жизни
По мнению большинства авторов, изучающих возникновение жизни на Земле, эволюционно первичной средой жизни была именно водная среда. Этому положению мы находим немало косвенных подтверждений. Прежде всего, большинство организмов не способн ...