BioXplorer

В процессе охлаждения праймеры, находящиеся в избытке, вновь эффективно гибридизуются, но уже не только с цепями исходной ДНК, но и с вновь синтезированными. Внесение в систему ДНК-полимеразы инициирует второй цикл полимеразной реакции. Многократное повторение описанной процедуры позволяет провести 30 и более циклов ферментативного удлинения праймеров. При этом число сегментов ДНК, ограниченных с обоих концов используемыми праймерами, с каждым циклом ПЦР увеличивается экспоненциально (приближается к зависимости 2n, где n — число циклов). Выход всех других продуктов реакции увеличивается по линейной зависимости (рис. 44). Таким образом, в процессе рассматриваемой реакции эффективно амплифицируется только та последовательность ДНК, которая ограничена праймерами.

Первоначально для ПЦР использовали фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Однако недостатком данного подхода являлось то, что после каждого цикла реакции необходимо было вносить в реакционную смесь новую порцию фермента. Кроме того, в оптимальных температурных условиях такой полимеразной реакции (37 °С) появлялись вторичные участки связывания праймеров и наблюдалась амплификация незапланированных сегментов генома, т. е. специфичность амплификации не была полной. Существенное улучшение метода полимеразной цепной реакции было достигнуто после замены фрагмента Кленова на ДНК-полимеразу термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-полимераза). Температурный оптимум реакции, направляемой Taq-полимеразой, находится в районе 70 °С. Другим важным свойством является то, что данная полимераза не инактивируется после длительной инкубации при 95 °С.

Используя Taq-полимеразу, удалось решить сразу две проблемы. Во-первых, термостабильная полимераза не инактивируется на этапе денатурации ДНК, и поэтому нет необходимости после каждого цикла реакции добавлять новую порцию фермента. Такое упрощение процедуры позволило автоматизировать проведение ПЦР, так как теперь требовалось лишь перенесение образца с определенным интервалом времени в разные температурные условия: 90—95 °С (температура денатурации) и 60—70 °С (температура ренатурации ДНК и ферментативной реакции). Во-вторых, высокий температурный оптимум реакции, катализируемой Taq-полимеразой, позволяет подбирать жесткие температурные условия отжига, обеспечивающие гибридизацию праймеров только в заданном районе изучаемого генома, что существенно повышает специфичность и чувствительность метода.

Используя метод ПЦР, можно in vitro селективно обогащать препарат ДНК фрагментом с определенной последовательностью в миллион и более раз. Это позволяет надежно выявлять однокопийные гены и их варианты в таких больших и сложных геномах, каким является геном человека. Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 105 клеток. Получаемый сегмент ДНК надежно выявляется в виде дискретной полосы после электрофоретического разделения молекул ДНК и окраски их этидиум бромидом. Если к праймеру пришить фермент, то ферментная метка будет накапливаться при амплифицировании. Продукт амплификации проверяется по принципу ИФА, то есть добавляется субстрат и отмечается изменение окраски. В качестве метки можно использовать стрептавидин (см. главу 3). Его можно пришивать как к праймеру, так и к нуклеотидам. В последнем случае нуклеотиды, меченные стрептавидином, добавляются к обычным, идущим на синтез комплементарной цепи ДНК. Этим достигается еще большее усиление сигнала.

Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования. Поскольку при этом не требуется промежуточный этап клонирования фрагмента ДНК в молекулярных векторах, ПЦР иногда называют бесклеточным молекулярным клонированием (cell-free molecular cloning). Автоматизированная процедура Taq-полимеразной цепной реакции, состоящая из 30 и более циклов, занимает 3—4 часа, что существенно быстрее и проще процедуры клонирования определенного

Другие статьи:

Рост мозга. Развитие коры головного мозга. Развитие интеллекта. Эмоциональное развитие. Функциональные блоки мозга
Дифференциация систем мозговой коры происходит постепенно, и это приводит к неравномерному созреванию отдельных мозговых структур, входящих в три функциональных блока мозга. При рождении у ребенка практически полностью сформированы подкор ...

Как «животное электричество» используется для решения важных задач
Подобно тому, как гигантский аксон кальмара является образцом нервного волокна, образцом нервной клетки является мотонейрон кошки. Эта клетка имеет относительно большие размеры и поэтому наиболее детально изучена. Мотонейрон имеет тело и ...

IL-1RA
Антитела к интерферону-a ...