В работе использовали безводные соли марки “х.ч.”(РФ), белково- витаминный концентрат дрожжей (Пензенский завод, РФ), 2Н2О (99,9% 2Н) и С2Н3О2Н (97,5 % 2Н), полученные из Российского научно-исследовательского центра “Изотоп” (Санкт-Петербург, РФ).

Бактериальные штаммы

. Объектом исследования служил мутантный штамм B. subtilis, способный продуцировать и выделять инозин в культуральную жидкость при росте на среде, содержащей в качестве ростовых факторов сухую дрожжевую биомассу, полученную на углеводородах. Штамм был получен из коллекции культур ГКПМ Российского научно-исследовательского центра генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

B. subtillis был предварительно адаптирован к росту на тяжёлой воде путём рассева на среде, приготовленной на основе 99,9 ат. % 2Н2О и использован в качестве продуцента инозина при ферментации. Отобранный штамм проявлял высокую жизнеспособность и стабильность по признаку инозинообразования при многократном пассивировании на агаризованных (2%-ный агар) средах. Штамм поддерживали на агаризованной среде, содержащей 2Н2O.

В качестве источника ростовых факторов при культивировании штамма-продуцента инозина использовали штамм факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum, полученный в работе [8].

Сырую биомассу B. methylicum, полученную в полностью дейтерированной среде dM9 [11] автоклавировали в 0,5 н. растворе 2 HCl (в 2H2O) при 08 ати в течении 30 мин.

Экстракцию липидов проводили смесью хлороформ-метанол (2:1) по методу Блайя и Дайера [12].

Гидролиз белка проводили в 6 н. 2 HCl (в 2H2O) (24 ч, 110 0С) [13].

Культивирование B. subtilis.

Для получения посевного материала использовали среду следующего состава (в % по весу): глюкоза 2; пептон 2; бакто-витаминный концентрат дрожжей 2; NaCl 0,25.

Культивирование B. subtilis проводили на среде, приготовленной на основе 99,9 ат.% 2Н2О (dFM-среда), содержащей (в % по весу): глюкоза 12; автоклавированная биомасса метилотрофных бактерий B. methylicum 2,5; NH4NO3 3; MgSO4 2; мел 2.

Среды стериллизовали при 0,8 ати. в течении 30-40 мин, рН доводили до 7,0-7,2 с помощью гидроокиси калия. Посевной материал выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл (с наполнением средой не более 20 мл) в условиях интенсивной аэрации при 30-320С. После суток посевной материал переносили в ферментационную среду в количестве 5-10 об.%. и культивировали в течении семи суток как при выращивании посевного материала.

Выделение инозина

. Клетки отделяли от культуральной жидкости на центрифуге Т-24 (Германия) (10 000 об/мин., 10 мин.). Супернатант концентрировали при 10 мм рт ст до объёма, в два раза меньше исходного. Белки удаляли, осаждая их метанолом при -40 С, осадок отделяли центрифугированием (10 000 об/мин, 10 мин). К супернатанту добавляли 1 г активированного угля и выдерживали реакционную смесь при -4 0С в течении суток. Десорбцию инозина проводили 50 %-ным раствором спирта в 25 %-ном растворе аммиака, десорбант лиофилизовали. Полученный продукт дважды промывали ацетоном, сушили при 500 С. Инозин перекристаллизовывали из метанола.

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) инозина осуществляли на пластинках “Silufol UV- 254”(Чехо-Словакия) в системе: н-бутанол-уксусная кислота-вода, 2:1:1. Инозин идентифицировали по поглощению в УФ свете.

Содержание инозина в культуральной жидкости определяли на приборе “Beckman DU-6” (США) в пробах культуральной жидкости, объемом 10 мкл при помощи стандартной калибровочной кривой (249 нм). Элюцию пятен проводили дистиллированной водой.

Аминокислотный анализ белковых гидролизатов проводили на приборе “Biotronic LC 50001” (ФРГ), 230 x 3,2 мм, рабочее давление 50-60 атм, скорость подачи буфера 18,5 мл/ч, нингидрина 9,25 мл/ч.

Уровни включения дейтерия в аминокислоты белка были исследованы методом масс-спектрометрии электронного удара на приборе “MB-80A” (Hitachi, Япониня) после модификации аминокислот в метиловые эфиры дансиламинокислот по методике, указанной в работе [8].

Масс-спектры инозина получены на приборе “MB-80A” (Hitachi, Япония) на глицериновой матрице, при потенциале 5 кВ и ионном токе 0,6-0,8 мА.


Другие статьи:

Репарация путем замены модифицированных остатков
Замена модифицированного нуклеотида обычно происходит в четыре этапа. Во-первых, фермент распознает этот нуклеотид и надрезает полинуклеотидную цепь вблизи него либо разрывает гликозидную связь между модифицированным основанием и дезоксир ...

Пища, приготовленная природой
Молоко— идеальный продукт питания. Павлов писал, что среди других видов человеческой еды особое место отведено молоку. Это «пища, приготовленная самой природой». Она входит в рацион всех цивилизованных народов с древнейших времен. Археол ...

Основные положения эволюционного учения Ч. Дарвина
Эволюционная теория Дарвина представляет собой целостное учение об историческом развитии органического мира. Она охватывает широкий круг проблем, важнейшими из которых являются доказательства эволюции, выявление движущих сил эволюции, опр ...