BioXplorer

Обнаружение вирусов в реакции иммунофлуоресценции.

В том случае, если размножение вируса в культуре клеток не сопровождается цитопатическим эффектом, гемадсорбцией, его присутствие можно обнаружить с помощью флуоресцирующих антител. Этот метод широко используют при диагностике классической чумы свиней, парвовирусной инфекции свиней и других болезней.

Метод, основанный на интерференции вирусов.

Построен на том, что некоторые вирусы в культуре клеток снижают способность размножаться в ней других вирусов. Например, вирус чумы свиней снижает инфекционную активность вируса ящура, вирус ньюкаслской болезни — вируса везикулярного стоматита и т. д.

Получение первично-трипсинизированных культур клеток из кожномышечной ткани развивающихся куриных эмбрионов.

Куриные эмбрионы 9—11-дневной инкубации овоскопируют. Отбирают яйца с подвижными эмбрионами и хорошо выраженными сосудами. На скорлупе простым карандашом отмечают границы воздушной камеры и расположение зародыша.

Поверхность скорлупы протирают йодированным спиртом и обжигают. Стерильными ножницами срезают скорлупу на 2—3 мм выше границы воздушной камеры, разрывают подскорлупную и хорионаллантоисную оболочки и за шейку извлекают эмбрион в стерильную чашку Петри. У эмбриона удаляют голову, лапки, крылья и внутренние органы. Оставшийся кожномышечный мешок переносят в стерильную майонезную банку (250 мл) и измельчают ножницами на кусочки 3—4 мм.

Измельченную ткань 2—3 раза отмывают раствором Хенкса от слизи и кровяных элементов до получения прозрачных сливных вод и переносят в колбу для трипсинизации. В колбу наливают 0,15%-ный раствор трипсина, подогретого до 35—37 °С (соотношение ткани и трипсина 1 : 3), вносят стерильный магнитик и ставят на магнитную мешалку

Трипсинизацию проводят дробно, т. е. через каждые 3—5 мин отделившиеся клетки вместе с трипсином сливают в центрифужные флаконы и помещают на лед или в холодильник для прекращения действия трипсина на клетки. К оставшемуся в колбе содержимому добавляют новую порцию трипсина. Скорость вращения на магнитной мешалке регулируют так, чтобы не было пены. Процесс повторяют несколько раз (3—5) до полного истощения ткани.

После трипсинизации суспензию клеток в растворе трипсина центрифугируют при 1000 мин-1 10 мин, надосадочную жидкость сливают (выбрасывают), а осадок клеток ресуспендируют в теплой (37 °С) питательной среде (в заведомо известном объеме) и фильтруют через 3-слойный марлевый фильтр.

После тщательного перемешивания клеток берут 1 мл для подсчета клеток.

Успех культивирования клеток в значительной степени зависит от посевной дозы. При малом количестве клеток не наблюдается образование монослоя даже при длительном культивировании. При слишком большой дозе клеток происходит интенсивная их пролиферация, и образованный слой клеток значительно раньше подвергается старению и неспецифической дегенерации. Клетки подсчитывают в камере Горяева.

К 1 мл взвеси клеток добавляют равный объем 0,1%-ного раствора кристаллвиолета, приготовленного на 0,1 н. растворе лимонной кислоты. После перемешивания камеру заполняют взвесью клеток и подсчитывают все клетки, имеющие ядро и неповрежденную цитоплазму; группу клеток с явными контурами считают за одну клетку.

На основании подсчета клеток в двух камерах высчитывают среднее арифметическое в одной из них. Число клеток в 1 мл суспензии (X) определяют по формуле

Х**(А:2- 1000): 0,9,

где А — среднее число клеток в одной камере; 2 — коэффициент разведения суспензии краской; 1000 — число мм3 в 1 см3; 0,9 — объем камеры Горясва, мм3.

После подсчета суспензию клеток разводят питательной средой с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось от 700 тыс. до 1 млн клеток (для куриных фибробластов).

Пример. В 1 мл полученной суспензии клеток (100 мл) содержится 4 млн клеток. Следовательно, всего в 100 мл суспензии 400 млн клеток. Посевная концентрация — 1 млн клеток в 1 мл. Исходную суспензию клеток (100 мл) доводят ростовой питательной средой до 400 мл.

Затем суспензию разливают в матрасы или пробирки. В пробирки заливают по 1 мл, в матрасы вместимостью 1000, 250 и 100 мл вносят соответственно 100, 40 и 15 мл взвеси клеток. Сосуды и пробирки плотно закрывают стерильными резиновыми пробками (для предупреждения защелачивания среды), делают надпись (вид культуры клеток и дату). На пробирках восковым карандашом проводят продольную черту, укладывают их чертой вверх в лотки с наклонным углом 5° и помещают в термостат при 37 °С.

Ежедневно культуры просматривают под малым увеличением микроскопа для определения характера роста. Если клетки не пролиферируют, выглядят округлыми, зернистыми, темными и отслаиваются от стекла, это свидетельствует о плохой обработке посуды или токсичности сыворотки, питательной среды. Пролиферирующие клетки светлые, связаны цитоплазматическими отростками, растут однослойным пластом. В процессе размножения клеток выделяются продукты обмена веществ, которые вызывают изменение рН питательной среды в кислую сторону (среда желтеет), что отрицательно влияет на клетки и может привести их к гибели. Такую среду заменяют свежей. Обычно сплошной монослой куриные фибробласты образуют через 36—48 ч.

Другие статьи:

Химизм аэробной фазы дыхания. Заслуга Г. Кребса
Вторая фаза дыхания — аэробная — требует присутствия кислорода. В аэробную фазу вступает пировиноградная кислота. В присутствии достаточного количества О2 пируват полностью окисляется до СО2 и Н2О. Еще в 1910 году шведским химиком Т. Тун ...

Клеточный цикл, периоды
Клеточный цикл включает строго детерминированный ряд последовательных процессов, согласно позиции Hartwellа, 1995. Клетка должна между двумя последовательными делениями удвоить все свои компоненты и свою массу. Таким образом клеточный цик ...

Изменчивость и наследственность
Для выяснения вопроса, какие движущие силы в процессе эволюции приводят к образованию новых видов, Дарвин обратился к изучению явлений изменчивости и наследственности. Изменчивость. Изменчивостью называют процесс возникновения различий м ...