Экспериментальная часть
Страница 1

Информация » Рестрикционное картирование » Экспериментальная часть

Поскольку именно космидная библиотека является основой нашей работы, мы решили подробно описать здесь ее создание.

Выделение геномной ДНК

Представленный здесь пример – экстракция ДНК из нематод. Этот метод универсален и включает минимум необходимых манипуляций.

Червей выращивают в жидкой питательной среде, отмывают, быстро замораживают и хранят в жидком азоте, в аликвотах по 1 г.

1. Размельчите одну аликвоту до порошкообразного состояния в ступке, охлажденной в жидком азоте, затем осторожно смешайте ее с 30 мл раствора, содержащего 100 мМ этилен-диаминотетрауксусной кислоты, рН 8,0, 0,5% додецилсульфата натрия и 50 мкг/мл протеиназы К-

2. Инкубируйте 2 ч при 50°С.

3. Охладите на льду, добавьте равный объем фенола и экстрагируйте 15 мин при 4°С, медленно перемешивая. Отцентрифугируйте и осторожно удалите водный слой пипеткой с широким носиком.

4. Добавьте два объема 95%-ного спирта и осторожно намотайте ДНК на толстую стеклянную палочку. Отмойте три раза 70%-ным спиртом, высушите на воздухе и суспендируйте в 3 мл раствора, содержащего 10 мм трис-HCl рН 7,4, 0,1 мМ ЭДТА.

Для последующего эффективного получения космид не обязательно использование градиента CsCl.

Приготовление фрагментов

Чтобы избежать ошибок в процессе картирования путем подбора пар по методу «отпечатков пальцев», важно не использовать при приготовлении фрагментов лигазную обработку. Мы предпочитаем двумерную электрофоретическую очистку выделению в градиенте плотности сахарозы, так как это дает более ясную картину распределения по размерам и достаточный выход эффективно клонируемых фрагментов.

Для предотвращения ошибок, связанных с «концевыми эффектами», желательно при анализе библиотеки, полученной на основе частичного гидролиза геномной ДНК, вводить ту же рестриктазу и в анализирующую рестрикционную систему. Так, например, частичная 5а «ЗА1-библиотека, анализируемая с помощью mdIII и Sa «3AI, не будет давать артефактов. Что касается космидных клонов, у которых фингерпринтные картины могут состоять из 20–30 полос, это требование необязательно, однако при картировании клонов концевые эффекты вызывают серьезные затруднения.

1. Подберите необходимые условия для частичного гидролиза. Выберите четыре варианта усиления жесткости обработки так, чтобы получались фрагменты требуемого размера.

2. Гидролизуйте 4 аликвоты по 40 мкг свежеэкстрагированной ДНК. Образцы заморозьте.

3. Перед проведением препаративного электрофореза сравните небольшое количество образца с K/Hindlll-маркерами, проведя электрофорез в 150 мл 0,3%-ного агарозного геля HGT ТАЕ, 1 В/см в течение 16 ч. Для корректного измерения размеров фрагментов все последующие определения должны быть проведены в тех же условиях.

4. После требуемого гидролиза объедините аликвоты ДНК, проведите фенольную экстракцию и спиртовое осаждение.

5. Растворите в 180 мкл раствора ТЕ. Добавьте 60 мкл неде-натурирующего красителя, нанесите в 16 лунок 0,4%-ного агарозного геля LGT ТАЕ.

6. Нанесите в качестве маркеров ТП и интактную ЯДНК- В препаративном геле это не укажет вам точно размеры фрагментов, но поможет аккуратно отрезать полоски геля. Проведите электрофорез в течение 20 ч при 1 В/см и окрасьте гель бромидом этидия.

7. Результат электрофореза вы можете увидеть, поместив гель под длинноволновую ультрафиолетовую лампу. Отрежьте полоски по 2 мм шириной от всех 16 дорожек для отделения гидролизованного материала.

8. Расплавьте агарозный гель, нагревая в течение 10 мин требуемые образцы при 68°С в пластиковых пробирках. Проведите фенольную экстракцию, сконцентрируйте изобутанолом до 0,3 мл, переосадите спиртом и проанализируйте фрагменты, как указано выше. 9. Проведите повторно препаративный LGT-гель-электрофорез для очистки выбранной вами фракции, экстрагируйте ее из требуемой полоски геля и окончательно проанализируйте минимальную аликвоту в аналитическом варианте. Ожидаемый выход –2–4 мкг ДНК из 160 мкг материала. 10. Растворите в 20 мкл ТЕ.

Смеси для упаковки космид

В продаже имеется большое количество упаковочных смесей, но из соображений экономии можно готовить их самим. Для этих целей мы с успехом использовали штаммы Escherichia coli: NS428 и NS433. Упаковочные смеси, полученные нами, позволяли получить до 106 космидных рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК-

Получены сведения, что Есо К-активность в упаковочных смесях может влиять на репрезентативность Я-библиотек, однако нет данных, что это возможно и для космидных. Имеются в продаже коммерческие Есо К-упаковочные смеси.

Страницы: 1 2


Другие статьи:

Как происходит процесс оплодотворения
Прежде чем мужская клетка встретится с женской, проходит от 3 до 6 часов. Продвигаясь вперед, многочисленные сперматозоиды не останавливаются ни на секунду. На своем пути они встречают множество преград, придуманных природой, в результате ...

Истина где-то рядом
Есть или не есть? Пытаясь вникнуть во все доводы "за" и "против", очень скоро обнаруживаешь себя в полной растерянности. Вроде бы перспектива продуктов с улучшенными пищевыми свойствами выглядит убедительно и заманчиво ...

Экспансия (инсерция) повторяющихся нуклеотидных последовательностей: миотоническая дистрофия (МД).
Встречаемость миотонической дистрофии составляет 1 на 8000. Это заболевание наследуется как аутосомное доминантное заболевание и представляет собой наиболее часто встречающуюся форму мышечной дистрофии у взрослых. Клинически это заболеван ...