BioXplorer

Соединение фрагментов с вектором

Предлагаемый метод пригоден для лигирования частичных гидролизатов Sau3Al в вектор Lorist2.

1. Добавьте вместе 1 мкл BamHI-обработанного де-фосфорилированного Lorist2; 2 мкл приготовленных 5аиЗА1-фрагментов; 2 мкл 10 X лигазного буферного раствора; 2 мкл 10 мМ АТР, рН 7,4; 2 мкл 0,1 М дитиотрей-тола; 10 мкл воды и 1 мкл лигазы. Для достижения максимально возможного лигирования поместите смесь в закрытый капилляр.

2. Инкубируйте 16 ч при 14°С.

3. Осторожно упакуйте, руководствуясь соответствующей методикой.

4. Храните библиотеку при 4°С под хлороформом.

5. Разведите 5 мкл упакованной библиотеки в 0,1 мл раствора для разведения.

Добавьте 0,2 мл стационарной культуры клеток. Мы используем для этих целей линию 1046. Ее следует регулярно пересевать через отдельные колонии, контролируя признак reck.

Инкубируйте 20 мин при 37°С. Добавьте 0,5 мл раствора CY и проинкубируйте дополнительно 50 мин. Высейте разные объемы на чашки с канамицином. Ожидаемый выход – 105–106 рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК.

Другие статьи:

Строение систем и органов человека. Центральная и вегетативная нервная система. Высшая нервная деятельность
Пищеварение. Переваривание и всасывание пищи происходят у человека в пищеварительном или желудочно-кишечном тракте, соединяющем ротовое отверстие с анальным. Пищеварительная трубка делится на участки, каждый из которых выполняет определ ...

Классификация насекомых
Существуют различные классификации насекомых. По одной из них Бессяжковые, Ногохвостки и Двухвостки выделяются в подкласс Скрыточелюстных (Entognatha) и противопоставляются Настоящим, или Открыточелюстным насекомым (Ectognatha). Подкласс ...

Общие сведения о фитобентосе. Классификация
Фитобентос (от греч. phyton – растение, bénthos — глубина) - совокупность растительных организмов, обитающих на грунте и в грунте морских и материковых водоёмов. По размерам фитобентос делят на крупные (макробентос), средние (мезоб ...