Экспериментальная частьСтраница 2
Соединение фрагментов с вектором
Предлагаемый метод пригоден для лигирования частичных гидролизатов Sau3Al в вектор Lorist2.
1. Добавьте вместе 1 мкл BamHI-обработанного де-фосфорилированного Lorist2; 2 мкл приготовленных 5аиЗА1-фрагментов; 2 мкл 10 X лигазного буферного раствора; 2 мкл 10 мМ АТР, рН 7,4; 2 мкл 0,1 М дитиотрей-тола; 10 мкл воды и 1 мкл лигазы. Для достижения максимально возможного лигирования поместите смесь в закрытый капилляр.
2. Инкубируйте 16 ч при 14°С.
3. Осторожно упакуйте, руководствуясь соответствующей методикой.
4. Храните библиотеку при 4°С под хлороформом.
5. Разведите 5 мкл упакованной библиотеки в 0,1 мл раствора для разведения.
Добавьте 0,2 мл стационарной культуры клеток. Мы используем для этих целей линию 1046. Ее следует регулярно пересевать через отдельные колонии, контролируя признак reck.
Инкубируйте 20 мин при 37°С. Добавьте 0,5 мл раствора CY и проинкубируйте дополнительно 50 мин. Высейте разные объемы на чашки с канамицином. Ожидаемый выход – 105–106 рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК.
Другие статьи:
Любительское
Любительское рыболовство – один из самых увлекательнейших и популярнейших видов отдыха. «Любовь к родной стране невозможна без любви в ее природе. Поэтому все, в том числе и рыбная ловля, что приближает нас к природе и роднит с ней – пат ...
Митоз.
Митоз, или непрямое деление, - основной способ размножения эукариотических клеток, обусловливающий, в частности, возможность увеличения их биомассы, рост и регенерацию. Митоз состоит из четырех фаз:
Первая – профаза – характеризуется нач ...
Клеточный цикл: регуляция перехода от G1- к S-фазе
До начала клеточного цикла белок p27, находясь в высокой концентрации, предотвращает активацию протеинкиназ CDK4 или CDK6 циклинами D1, D2 или D3. В таких условиях клетка остается в фазе G0 или ранней фазе G1 до получения митогенного стим ...