Экспериментальная частьСтраница 2
Соединение фрагментов с вектором
Предлагаемый метод пригоден для лигирования частичных гидролизатов Sau3Al в вектор Lorist2.
1. Добавьте вместе 1 мкл BamHI-обработанного де-фосфорилированного Lorist2; 2 мкл приготовленных 5аиЗА1-фрагментов; 2 мкл 10 X лигазного буферного раствора; 2 мкл 10 мМ АТР, рН 7,4; 2 мкл 0,1 М дитиотрей-тола; 10 мкл воды и 1 мкл лигазы. Для достижения максимально возможного лигирования поместите смесь в закрытый капилляр.
2. Инкубируйте 16 ч при 14°С.
3. Осторожно упакуйте, руководствуясь соответствующей методикой.
4. Храните библиотеку при 4°С под хлороформом.
5. Разведите 5 мкл упакованной библиотеки в 0,1 мл раствора для разведения.
Добавьте 0,2 мл стационарной культуры клеток. Мы используем для этих целей линию 1046. Ее следует регулярно пересевать через отдельные колонии, контролируя признак reck.
Инкубируйте 20 мин при 37°С. Добавьте 0,5 мл раствора CY и проинкубируйте дополнительно 50 мин. Высейте разные объемы на чашки с канамицином. Ожидаемый выход – 105–106 рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК.
Другие статьи:
Лейцинаминопептидаза
Лейцинаминопептидаза (КФ 3.4.11.1) проявляет широкую субстратную специфичность и отщепляет практически любые N-концевые аминокислоты, за исключением аланина и цистеина [56]. Она гидролизует амид лейцина лучше, чем ариламид лейцина, с мень ...
Структура и поведение ДНК. Компоненты молекулы ДНК и соединяющие их химические связи
С помощью химических и физических методов установлено, что ДНК - это полимер, состоящий из четырех разных, но родственных мономеров. Каждый мономер - нуклеотид - содержит одно из четырех гетероциклических азотистых оснований: аденин, гуан ...
Фундаментальные типы взаимодействий в физике. Почему они так называются?
Какие законы сохранения фундаментальны для всего естествознания и почему?
Мир не представляется набором тел, он подвижен, активен и все, что заполняет мир, подвержено движению и изменению. Классическая механика признала, что существует движение и без приложенной силы, и только отклонение от прямолинейности равн ...