Экспериментальная часть
Страница 2

Информация » Рестрикционное картирование » Экспериментальная часть

Соединение фрагментов с вектором

Предлагаемый метод пригоден для лигирования частичных гидролизатов Sau3Al в вектор Lorist2.

1. Добавьте вместе 1 мкл BamHI-обработанного де-фосфорилированного Lorist2; 2 мкл приготовленных 5аиЗА1-фрагментов; 2 мкл 10 X лигазного буферного раствора; 2 мкл 10 мМ АТР, рН 7,4; 2 мкл 0,1 М дитиотрей-тола; 10 мкл воды и 1 мкл лигазы. Для достижения максимально возможного лигирования поместите смесь в закрытый капилляр.

2. Инкубируйте 16 ч при 14°С.

3. Осторожно упакуйте, руководствуясь соответствующей методикой.

4. Храните библиотеку при 4°С под хлороформом.

5. Разведите 5 мкл упакованной библиотеки в 0,1 мл раствора для разведения.

Добавьте 0,2 мл стационарной культуры клеток. Мы используем для этих целей линию 1046. Ее следует регулярно пересевать через отдельные колонии, контролируя признак reck.

Инкубируйте 20 мин при 37°С. Добавьте 0,5 мл раствора CY и проинкубируйте дополнительно 50 мин. Высейте разные объемы на чашки с канамицином. Ожидаемый выход – 105–106 рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК.

Страницы: 1 2 


Другие статьи:

Гаметогенез и развитие растений
У растений гаметогенез протекает значительно сложнее. При этом процесс мейоза имеет место не на стадии образования гамет, а на стадии образования спор. Кроме того, у растений наблюдается чередование поколений с диплоидным и гаплоидным наб ...

Обсуждение результатов исследования
В основе развития ишемии мозга лежит нарушение кровообращения. В связи с этим первостепенное значение приобретает изучение биохимических процессов, лежащих в основе вазомоторных реакций, возникающих в ответ на церебральную ишемию. Многоч ...

Первые шаги климатологии.
Путешественники и мореплаватели древности уже весьма давно обратили внимание на различие климатов тех или других стран, которые им довелось посетить. Климатология, таким образом, в течение веков шла рука об руку с географией, будучи ее не ...