BioXplorer

Соединение фрагментов с вектором

Предлагаемый метод пригоден для лигирования частичных гидролизатов Sau3Al в вектор Lorist2.

1. Добавьте вместе 1 мкл BamHI-обработанного де-фосфорилированного Lorist2; 2 мкл приготовленных 5аиЗА1-фрагментов; 2 мкл 10 X лигазного буферного раствора; 2 мкл 10 мМ АТР, рН 7,4; 2 мкл 0,1 М дитиотрей-тола; 10 мкл воды и 1 мкл лигазы. Для достижения максимально возможного лигирования поместите смесь в закрытый капилляр.

2. Инкубируйте 16 ч при 14°С.

3. Осторожно упакуйте, руководствуясь соответствующей методикой.

4. Храните библиотеку при 4°С под хлороформом.

5. Разведите 5 мкл упакованной библиотеки в 0,1 мл раствора для разведения.

Добавьте 0,2 мл стационарной культуры клеток. Мы используем для этих целей линию 1046. Ее следует регулярно пересевать через отдельные колонии, контролируя признак reck.

Инкубируйте 20 мин при 37°С. Добавьте 0,5 мл раствора CY и проинкубируйте дополнительно 50 мин. Высейте разные объемы на чашки с канамицином. Ожидаемый выход – 105–106 рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК.

Другие статьи:

Оптимальное пищедобывательное поведение
Многие животные способны выбирать из различных видов пищи ту, которая соответствует их физиологическим потребностям. Но для того чтобы получить пищу, животные должны расходовать энергию. Кроме того, им приходится тратить ценное время, рас ...

Классификация тканей
Филогенетическая - в основе лежит происхождение ткани и морфофункциональная. Покровные эпителиальные ткани. Функции - защитная и трофическая. В большом количестве содержит стволовые клетки и характеризуется высокой способностью к регенер ...

Развитие и рост костей
В онтогенезе человека большинство костей скелета последовательно проходит три стадии в своем развитии. Это перепончатая, хрящевая и костная стадии. Минуют хрящевую стадию так называемые покровные кости (кости свода черепа, лица, ключица). ...