Экспериментальная часть
Страница 2

Информация » Рестрикционное картирование » Экспериментальная часть

Соединение фрагментов с вектором

Предлагаемый метод пригоден для лигирования частичных гидролизатов Sau3Al в вектор Lorist2.

1. Добавьте вместе 1 мкл BamHI-обработанного де-фосфорилированного Lorist2; 2 мкл приготовленных 5аиЗА1-фрагментов; 2 мкл 10 X лигазного буферного раствора; 2 мкл 10 мМ АТР, рН 7,4; 2 мкл 0,1 М дитиотрей-тола; 10 мкл воды и 1 мкл лигазы. Для достижения максимально возможного лигирования поместите смесь в закрытый капилляр.

2. Инкубируйте 16 ч при 14°С.

3. Осторожно упакуйте, руководствуясь соответствующей методикой.

4. Храните библиотеку при 4°С под хлороформом.

5. Разведите 5 мкл упакованной библиотеки в 0,1 мл раствора для разведения.

Добавьте 0,2 мл стационарной культуры клеток. Мы используем для этих целей линию 1046. Ее следует регулярно пересевать через отдельные колонии, контролируя признак reck.

Инкубируйте 20 мин при 37°С. Добавьте 0,5 мл раствора CY и проинкубируйте дополнительно 50 мин. Высейте разные объемы на чашки с канамицином. Ожидаемый выход – 105–106 рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК.

Страницы: 1 2 


Другие статьи:

Классические законы Г.Менделя
Основные законы наследуемости были описаны чешским монахом Грегором Менделем более века назад, когда он преподавал физику и естественную историю в средней школе г. Брюнна (г. Брно). Мендель занимался селекционированием гороха, и именно г ...

Основные дереворазрушающие грибы
Класс Базидиомицеты (Basidiomycetes) - высшие грибы с многоклеточным мицелием. К ним относятся около 30 тыс. видов. Среди этих грибов есть паразиты растений (например, широко распространенные и очень опасные для сельскохозяйственных расте ...

Исследование динамики ТБК-активных продуктов при моделировании ишемии головного мозга
Нарушения кровообращения, наступающие при ишемическом повреждении мозга, вызывают усиленную генерацию АФК, и, как следствие, усиление ПОЛ. Данные по изучению содержания ТБК-АП представлены на рис. 2 и рис. 3. (Приложение 2‚ табл. 1). При ...