Экспериментальная частьСтраница 2
Соединение фрагментов с вектором
Предлагаемый метод пригоден для лигирования частичных гидролизатов Sau3Al в вектор Lorist2.
1. Добавьте вместе 1 мкл BamHI-обработанного де-фосфорилированного Lorist2; 2 мкл приготовленных 5аиЗА1-фрагментов; 2 мкл 10 X лигазного буферного раствора; 2 мкл 10 мМ АТР, рН 7,4; 2 мкл 0,1 М дитиотрей-тола; 10 мкл воды и 1 мкл лигазы. Для достижения максимально возможного лигирования поместите смесь в закрытый капилляр.
2. Инкубируйте 16 ч при 14°С.
3. Осторожно упакуйте, руководствуясь соответствующей методикой.
4. Храните библиотеку при 4°С под хлороформом.
5. Разведите 5 мкл упакованной библиотеки в 0,1 мл раствора для разведения.
Добавьте 0,2 мл стационарной культуры клеток. Мы используем для этих целей линию 1046. Ее следует регулярно пересевать через отдельные колонии, контролируя признак reck.
Инкубируйте 20 мин при 37°С. Добавьте 0,5 мл раствора CY и проинкубируйте дополнительно 50 мин. Высейте разные объемы на чашки с канамицином. Ожидаемый выход – 105–106 рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК.
Другие статьи:
Основные концепции этологии
Основы этологии, или науки о поведении животных, были заложены в XIX веке. После первых экспериментов Д. Сполдинга по изучению поведения животных, Ч. Уитмен, тщательно наблюдая за поведением животных разных видов, указал, что многие инсти ...
Философские проблемы антропогенеза.
Единство природного и социального в человеке. Индивид, индивидуальность, личность. Личность и общество. Цель и смысл жизни человека. Крайне усложняющаяся система изучения человека, охватившая почти весь диапазон познания (от физико-матем ...
Конфигурация и упаковка ацильных цепей в бислое
Рассмотрим сначала насыщенные углеводородные цепи. В них возможно свободное вращение вокруг каждой С—С-связи, характеризующееся энергетическим минимумом, особенно четким в случае ньюменовской проекции. Наиболее стабильна транс-конфигураци ...