Экспериментальная часть
Страница 2

Информация » Рестрикционное картирование » Экспериментальная часть

Соединение фрагментов с вектором

Предлагаемый метод пригоден для лигирования частичных гидролизатов Sau3Al в вектор Lorist2.

1. Добавьте вместе 1 мкл BamHI-обработанного де-фосфорилированного Lorist2; 2 мкл приготовленных 5аиЗА1-фрагментов; 2 мкл 10 X лигазного буферного раствора; 2 мкл 10 мМ АТР, рН 7,4; 2 мкл 0,1 М дитиотрей-тола; 10 мкл воды и 1 мкл лигазы. Для достижения максимально возможного лигирования поместите смесь в закрытый капилляр.

2. Инкубируйте 16 ч при 14°С.

3. Осторожно упакуйте, руководствуясь соответствующей методикой.

4. Храните библиотеку при 4°С под хлороформом.

5. Разведите 5 мкл упакованной библиотеки в 0,1 мл раствора для разведения.

Добавьте 0,2 мл стационарной культуры клеток. Мы используем для этих целей линию 1046. Ее следует регулярно пересевать через отдельные колонии, контролируя признак reck.

Инкубируйте 20 мин при 37°С. Добавьте 0,5 мл раствора CY и проинкубируйте дополнительно 50 мин. Высейте разные объемы на чашки с канамицином. Ожидаемый выход – 105–106 рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК.

Страницы: 1 2 


Другие статьи:

Влияние различных факторов среды на рыбца
Рыбы, как и все другие организмы, обитающие в водоемах, находятся в тесном взаимодействии с абиотическими факторами среды — совокупностью условий неживой природы, и биотическими факторами среды, включающими в себя разнообразные отношения ...

Способы разрушения тканей и клеток
Для разрушения клеток чаще всего применяют физические методы. Большинство животных клеток разрушается сравнительно легко, однако при разрушении растительных и бактериальных клеток зачастую приходится сталкиваться со значительными трудност ...

Гастрит
Гастрит это заболевание желудка, характеризующееся воспалением его слизистой оболочки. Причины Гастрита разнообразны. Обычно он возникает вследствие раздражения слизистой оболочки желудка обильной, грубой, острой, слишком горячей или холо ...