Экспериментальная часть
Страница 2

Информация » Рестрикционное картирование » Экспериментальная часть

Соединение фрагментов с вектором

Предлагаемый метод пригоден для лигирования частичных гидролизатов Sau3Al в вектор Lorist2.

1. Добавьте вместе 1 мкл BamHI-обработанного де-фосфорилированного Lorist2; 2 мкл приготовленных 5аиЗА1-фрагментов; 2 мкл 10 X лигазного буферного раствора; 2 мкл 10 мМ АТР, рН 7,4; 2 мкл 0,1 М дитиотрей-тола; 10 мкл воды и 1 мкл лигазы. Для достижения максимально возможного лигирования поместите смесь в закрытый капилляр.

2. Инкубируйте 16 ч при 14°С.

3. Осторожно упакуйте, руководствуясь соответствующей методикой.

4. Храните библиотеку при 4°С под хлороформом.

5. Разведите 5 мкл упакованной библиотеки в 0,1 мл раствора для разведения.

Добавьте 0,2 мл стационарной культуры клеток. Мы используем для этих целей линию 1046. Ее следует регулярно пересевать через отдельные колонии, контролируя признак reck.

Инкубируйте 20 мин при 37°С. Добавьте 0,5 мл раствора CY и проинкубируйте дополнительно 50 мин. Высейте разные объемы на чашки с канамицином. Ожидаемый выход – 105–106 рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК.

Страницы: 1 2 


Другие статьи:

Влияние температуры и pH среды на сорбционные свойства клетчатки относительно Cs-137
Влияние температуры на сорбцию. Наибольший интерес для изучения сорбционных свойств клетчатки представляет температура 39ºС, так как именно такая температура соответственно ЖКТ КРС. Для поддержания температуры в ходе проведения данн ...

Метод определения концентрации малонового диальдегида в сыворотке крови
Концентрацию малонового диальдегида определяли по методу Uchiyama M., Mihara M. [75]. К 3 мл 1,4 % ортофосфорной кислоты добавляли 0,25 мл сыворотки крови, затем приливали 1 мл 0,5 % раствора тиобарбитуровой кислоты и помещали в кипящую в ...

Образование мицелл
Рассмотрим, что происходит при растворении углеводородов с длинной цепью в воде. Из-за весьма неблагоприятных "гидрофобных" взаимодействий, описанных в - предыдущем разделе, их растворимость будет очень мала. Такие углеводороды, ...