Экспериментальная частьСтраница 2
Соединение фрагментов с вектором
Предлагаемый метод пригоден для лигирования частичных гидролизатов Sau3Al в вектор Lorist2.
1. Добавьте вместе 1 мкл BamHI-обработанного де-фосфорилированного Lorist2; 2 мкл приготовленных 5аиЗА1-фрагментов; 2 мкл 10 X лигазного буферного раствора; 2 мкл 10 мМ АТР, рН 7,4; 2 мкл 0,1 М дитиотрей-тола; 10 мкл воды и 1 мкл лигазы. Для достижения максимально возможного лигирования поместите смесь в закрытый капилляр.
2. Инкубируйте 16 ч при 14°С.
3. Осторожно упакуйте, руководствуясь соответствующей методикой.
4. Храните библиотеку при 4°С под хлороформом.
5. Разведите 5 мкл упакованной библиотеки в 0,1 мл раствора для разведения.
Добавьте 0,2 мл стационарной культуры клеток. Мы используем для этих целей линию 1046. Ее следует регулярно пересевать через отдельные колонии, контролируя признак reck.
Инкубируйте 20 мин при 37°С. Добавьте 0,5 мл раствора CY и проинкубируйте дополнительно 50 мин. Высейте разные объемы на чашки с канамицином. Ожидаемый выход – 105–106 рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК.
Другие статьи:
IL-3
Интерлейкин-3 ...
Жировой обмен организма
Пищевые жиры представляют собой эфиры глицерина и высших жирных кислот. Последние обычно содержат четное число углеродных атомов и делятся на две большие группы: насыщенные и ненасыщенные. Насыщенные жирные кислоты в большом количестве (д ...
Влияние освещённости, уровня и течения воды на рыбца
Течения влияют на физические, химические и биологические процессы, происходящие в водоемах. Теплые течения, приносящие тепло в холодноводные районы, создают благоприятные условия для развития кормовых организмов, а следовательно, и для ры ...