BioXplorer

Соединение фрагментов с вектором

Предлагаемый метод пригоден для лигирования частичных гидролизатов Sau3Al в вектор Lorist2.

1. Добавьте вместе 1 мкл BamHI-обработанного де-фосфорилированного Lorist2; 2 мкл приготовленных 5аиЗА1-фрагментов; 2 мкл 10 X лигазного буферного раствора; 2 мкл 10 мМ АТР, рН 7,4; 2 мкл 0,1 М дитиотрей-тола; 10 мкл воды и 1 мкл лигазы. Для достижения максимально возможного лигирования поместите смесь в закрытый капилляр.

2. Инкубируйте 16 ч при 14°С.

3. Осторожно упакуйте, руководствуясь соответствующей методикой.

4. Храните библиотеку при 4°С под хлороформом.

5. Разведите 5 мкл упакованной библиотеки в 0,1 мл раствора для разведения.

Добавьте 0,2 мл стационарной культуры клеток. Мы используем для этих целей линию 1046. Ее следует регулярно пересевать через отдельные колонии, контролируя признак reck.

Инкубируйте 20 мин при 37°С. Добавьте 0,5 мл раствора CY и проинкубируйте дополнительно 50 мин. Высейте разные объемы на чашки с канамицином. Ожидаемый выход – 105–106 рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК.

Другие статьи:

Микроэкологический риск при использовании высоких технологий
Результаты, полученные в процессе многолетней эксплуатации орбитальных станций «Салют», «Мир», а сейчас МКС, свидетельствует о том, что в условиях полёта в состоянии микробиоценозов человека, как правило, отмечались признаки активации усл ...

Применение ферроцина
Ферроцин применяют для снижения уровня содержания цезия-137 в молоке и мышечной ткани КРС при содержании их на территории радиоактивного загрязнения. Ферроцин назначают: - в форме болюса, приготовленного из смеси сернокислого бария (75%) ...

Основные положения эволюционного учения Ч. Дарвина
Эволюционная теория Дарвина представляет собой целостное учение об историческом развитии органического мира. Она охватывает широкий круг проблем, важнейшими из которых являются доказательства эволюции, выявление движущих сил эволюции, опр ...