BioXplorer

Соединение фрагментов с вектором

Предлагаемый метод пригоден для лигирования частичных гидролизатов Sau3Al в вектор Lorist2.

1. Добавьте вместе 1 мкл BamHI-обработанного де-фосфорилированного Lorist2; 2 мкл приготовленных 5аиЗА1-фрагментов; 2 мкл 10 X лигазного буферного раствора; 2 мкл 10 мМ АТР, рН 7,4; 2 мкл 0,1 М дитиотрей-тола; 10 мкл воды и 1 мкл лигазы. Для достижения максимально возможного лигирования поместите смесь в закрытый капилляр.

2. Инкубируйте 16 ч при 14°С.

3. Осторожно упакуйте, руководствуясь соответствующей методикой.

4. Храните библиотеку при 4°С под хлороформом.

5. Разведите 5 мкл упакованной библиотеки в 0,1 мл раствора для разведения.

Добавьте 0,2 мл стационарной культуры клеток. Мы используем для этих целей линию 1046. Ее следует регулярно пересевать через отдельные колонии, контролируя признак reck.

Инкубируйте 20 мин при 37°С. Добавьте 0,5 мл раствора CY и проинкубируйте дополнительно 50 мин. Высейте разные объемы на чашки с канамицином. Ожидаемый выход – 105–106 рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК.

Другие статьи:

Антропологические различия фигуры человека - половые, лицевые. Условия создания рас
Все современное человечество принадлежит к одному виду. Единство человечества вытекает из общности происхождения, сходства строения и плодовитости потомства, браков между представителями разных рас. Общий уровень физического и умственного ...

Типы рекомбинации
Существуют три типа рекомбинации: общая, или гомологичная, сайт-специфическая и случайная, или негомологичная. Общая рекомбинация. Общая рекомбинация происходит, как правило, между протяженными участками идентичных или гомологичных нукле ...

Как сохранить слух ребенка? (написать заметку для родительского уголка)
Заметка для родителей. Уважаемые родители сохраняйте слух вашего ребенка! Каждый день миллионы людей подвергаются шумовому воздействию, которое эксперты определяют как «раздражающее слух и вредное для здоровья». И действительно, независ ...