Метод определения уровня интерлейкина-4 в сыворотке кровиСтраница 2
· Стрипы. Вскрыть и установить на рамку необходимое количество стрипов. Оставшиеся стрипы хранить в герметично закрытом пакете из фольгированного полиэтилена при температуре
· Сывороточный буфер. В стакан с 480 мл дистиллированной воды добавить содержимое флакона с маркировкой"Буфер Р". Тщательно перемешать, избегая пенообразования. Xранить промывочный буфер при температуре +2…8°С.
· Буфер А. Готов к использованию. Хранить закрытым при температуре +2…6° С.
· Набор антител анти-IL-4-биотин. В зависимости от количества используемых стрипов подготовить необходимый объем однократного раствора антител путем смешивания 40 мкл концентрированного антител с 1 мл промывочного буфера из расчета на один стрип. Однократный раствор антител должен быть использован в течение часа, длительному хрипению не подлежит.
· Конъюгат Е. авидин-пероксидаза. В зависимости от количества используемых стрипов подготовить необходимый объем однократного раствора конъюгата путем смешивания 40 мкл концентрированного конъюгата Е с 1 мл промывочного буфера из расчета на один стрип. Однократный раствор конъюгата Е должен быть использован в течение часа, длительному хранению не подлежит.
· Субстратная смесь приготовляется непосредственно перед употреблением.
· "Стоп-реагент" готов к использованию.
Проведение анализа:
|
1 |
Внести во все лунки по 0,1 мл "Буфер А". Расход реагентов в табл.1 |
|
2 |
В соответствующие лунки по 0,1 мл калибровочных проб или исследуемой сыворотки, внесение образцов не должно занимать более 15 мин |
|
3 |
Инкубировать стрипы при температуре 37°С в течение 2 ч со встряхиванием |
|
4 |
Удалить содержимое лунок декантированием и промыть лунки три раза. При промывке во все лунки добавить по 0,25 мл промывочного буфера |
|
5 |
На шейкере в течение 5-10 сек с последующим декантированием. При каждом декантировании тщательно удалять остатки жидкости из лунок постукиванием рамки со стрипами в положении по фильтровальной бумаге |
|
6 |
Внести во все лунки по 0,1 мл раствора антител |
|
7 |
Инкубировать стрипы при температуре 37°С в течение 1 часа со встряхиванием |
|
8 |
Лунки промыть |
|
9 |
Внести во все лунки по 0,1 мл раствора конъюгата Е |
|
10 |
Инкубировать стрипы при температуре 37°С в течение 30 минут со встряхиванием |
|
11 |
Лунки промыть |
|
12 |
Перед окраской стрипы сполоснуть дистиллированной водой для более полного удаления не связавшего конъюгата |
|
13 |
Внести во все лунки по 0,1 мл субстратной смеси и инкубировать стрипы в темноте в течение 15-20 мин в зависимости от степени развития окраски |
|
14 |
Добавить во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и субстратную смесь, по 0,05 мл "Стоп-реагента" для остановки ферментной реакции, встряхивать на шейкере 5мин |
|
15 |
Измерить оптическую плотность в лунках при длине волны 450 нм |
|
16 |
Построить для калибровочных проб график зависимости оптической плотности в единицах оптической плотности (ОП) от концентрации IL-4 в пг\мл. |
|
17 |
Определить содержание IL-4 в пробах по калибровочному графику |
Другие статьи:
Трансгенные продукты: есть или не есть?
Когда речь заходит о генетически модифицированных продуктах, воображение тут же рисует грозных мутантов. Легенды об агрессивных, вытесняющих из природы своих сородичей трансгенных растениях, которые Америка забрасывает в доверчивую Россию ...
Периодизация первобытной истории.
Отметим сразу, что в настоящее время среди ученых, занимающихся исследованием древнейшей истории человечества единого мнения о периодизации этой истории нет. Существуют несколько специальных и общая (историческая) периодизации первобытной ...
Orrorin tugenensis
Другая древнейшая двуногая гоминида обнаружена 25 октября 2000 года при раскопках в Кении неподалеку от Great Rift Valley (Aiello & Collard, 2001). Останки существа, получившего прозвище Человек Миллениума, но официально названного Or ...