Метод определения уровня гамма-интерферона в сыворотке крови
Страница 2

Информация » Исследование уровня цитокинов у больных с гнойно-воспалительными заболеваниями » Метод определения уровня гамма-интерферона в сыворотке крови

· Буфер А. Готов к использованию. Хранить закрытым при температуре +2…6° С.

· Набор антител анти- γИФН-биотин. В зависимости от количества используемых стрипов подготовить необходимый объем однократного раствора антител путем смешивания 40 мкл концентрированного антител с 1 мл промывочного буфера из расчета на один стрип. Однократный раствор антител должен быть использован в течение часа, длительному хрипению не подлежит.

· Конъюгат Е. авидин-пероксидаза. В зависимости от количества используемых стрипов подготовить необходимый объем однократного раствора конъюгата путем смешивания 40 мкл концентрированного конъюгата Е с 1 мл промывочного буфера из расчета на один стрип. Однократный раствор конъюгата Е должен быть использован в течение часа, длительному хранению не подлежит.

· Субстратная смесь приготовляется непосредственно перед употреблением.

· "Стоп-реагент" готов к использованию.

Проведение анализа:

1

Внести во все лунки по 0,1 мл "Буфер А". Расход реагентов в табл.1

2

В соответствующие лунки по 0,1 мл калибровочных проб или исследуемой сыворотки, внесение образцов не должно занимать более 15 мин

3

Инкубировать стрипы при температуре 37°С в течение 2 ч со встряхиванием

4

Удалить содержимое лунок декантированием и промыть лунки три раза. При промывке во все лунки добавить по 0,25 мл промывочного буфера

5

На шейкере в течение 5-10 сек с последующим декантированием. При каждом декантировании тщательно удалять остатки жидкости из лунок постукиванием рамки со стрипами в положении по фильтровальной бумаге

6

Внести во все лунки по 0,1 мл раствора антител

7

Инкубировать стрипы при температуре 37°С в течение 1 часа со встряхиванием

8

Лунки промыть

9

Внести во все лунки по 0,1 мл раствора конъюгата Е

10

Инкубировать стрипы при температуре 37°С в течение 30 минут со встряхиванием

11

Лунки промыть

12

Перед окраской стрипы сполоснуть дистиллированной водой для более полного удаления не связавшего конъюгата

13

Внести во все лунки по 0,1 мл субстратной смеси и инкубировать стрипы в темноте в течение 15-20 мин в зависимости от степени развития окраски

14

Добавить во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и субстратную смесь, по 0,05 мл "Стоп-реагента" для остановки ферментной реакции, встряхивать на шейкере 5мин

15

Измерить оптическую плотность в лунках при длине волны 450 нм

16

Построить для калибровочных проб график зависимости оптической плотности в единицах оптической плотности (ОП) от концентрации γИФН в пг\мл.

17

Определить содержание γИФН в пробах по калибровочному графику

Таблица 3. Расход реагентов для проведения анализа

Количество используемых стрипов

шт

Буфер А

мл

Раствор антител

мл

Конъюгат

мл

Буфер Р

мл

Субстратная смесь

Раствор ТМБ

мл

Буфер С

мл

2

2

2

2

50

0,4

2

3

3

3

3

75

0,6

3

4

4

4

4

100

0,8

4

5

5

5

5

125

1,0

5

6

6

6

6

150

1,2

6

7

7

7

7

175

1,4

7

8

8

8

8

200

1,6

8

9

9

9

9

225

1,8

9

10

10

10

10

250

2,0

10

11,12

12

12

12

300

2,0

10

Страницы: 1 2 3


Другие статьи:

Суточные ритмы
Они являются предметом наиболее многочисленных исследований. Отражая циркадную организацию функций организма, эти ритмы характеризуются многообразными изменениями проявлений жизнедеятельности. Существенное значение имеет характер активнос ...

Нервная система
Нервная система достигает у млекопитающих по сравнению с другими позвоночными совершенства. Она обеспечивает тонкое приспособление к постоянно меняющимся условиям среды, точное согласование работы всех органов, очень интенсивный обмен вещ ...

Молекулярный
Любая живая система, как бы сложно она ни была организована, состоит из биологических макромолекул: нуклеиновых кислот, белков, полисахаридов, а также других важных органических веществ. С этого уровня начинаются разнообразные процессы жи ...