Эта методика исходно предназначалась для изучения вирусных частиц, а к мембранным белкам она была впервые применена Хендерсоном и Ануином, исследовавшими бактериородопсин. В принципе этот метод позволяет получить структурную информацию, достаточную для того, чтобы проследить ход полипептидной цепи, но реализовать эту возможность пока не удалось. Рассеяние электронов достаточно велико для того, чтобы визуализировать отдельные молекулы с помощью электронного микроскопа. Однако интенсивность пучка электронов, необходимая для этого, слишком велика, сам образец при этом разрушается, и для получения высокого разрешения приходится использовать гораздо меньшие интенсивности. В обычной трансмиссионной электронной микроскопии для усиления контраста используется негативное контрастирование, но оно непригодно для выявления структурных деталей тех участков белка, которые погружены в бислой, поскольку они недоступны для красителя. Красители редко используются для реконструкции изображения; исключение составляют лишь исследования по визуализации водных каналов.

Чтобы получить достаточную информацию с помощью пучка электронов низкой интенсивности, необходимо просуммировать изображения многих молекул. Именно с этой целью используют двумерные упорядоченные структуры. Сами изображения представляют собой двумерные проекции электронной плотности образца. Проведя оцифровку этих изображений и применив преобразование Фурье, можно выявить повторяющиеся элементы и устранить шумы. Еще раз применив преобразование Фурье к этим повторяющимся элементам, реконструируют исходное изображение, но уже без шумов. В основе процедуры лежит удачный прием, позволяющий суммировать изображения, полученные от сотен и тысяч молекул в поле зрения микроскопа.

Проекции электронной плотности в двух направлениях недостаточны для построения трехмерной структуры. Поэтому, наклоняя образец, получают проекции образца под разными углами и используют их для реконструкции трехмерного изображения объекта. Таким образом строят карту электронной плотности в мембране на Разных уровнях. Обычно приводят данные о профиле электронной плотности через каждые 15-25 А.

Таблица 2. Мембранные белки, структуру которых определяли методом реконструкции изображения

Белок

Трехмерное разрешение, А

Ссылки

1. NAPH: убихинон оксидоредуктаза (митохондрии)

13

[ИЗ]

2. Цитохром с-оксидаза (митохондрии)

20

[314, 466]

3. Убихинол-цитохром с - оксидоредуктаза (митохондрии)

25

[843]

4. Свет ос обирающий комплекс, содержащий

16

[795]

В табл.2 представлен список белков, которые были изучены этим методом. Во всех случаях, кроме бактериородопсина, уровень разрешения был достаточен только для очерчивания общих контуров молекул и определения их размеров.

Однако даже такая информация может быть очень ценной. Например, выяснилось, что многие из этих молекул в двумерных кристаллах существуют в виде отдельных мультимеров, а порин и бактериородопсин являются тримерами.

В случае порина существует четко наблюдаемый канал, в образовании которого на внешней поверхности клетки участвует каждый из трех отдельных полипептидов; сливаясь, эти полипептиды образуют одиночный канал на периплазматической поверхности наружной мембраны Е. coli.

Страницы: 1 2


Другие статьи:

Поведение и рацион
Некоторые совы охотятся днем, как, например, из российских сов - белая сова, воробьиный сычик и ястребиная сова, некоторые другие, как домовый сыч, охотятся одинаково как днем, так и ночью. Однако большинство сов - настоящие ночные птицы, ...

Класс Реки.
Группа типов равнинные реки лесной зоны. Реки Амур и Зея, характеризуются следующими признаками: берега обрывистые, хорошо задерненные, сложенные из песка и глины, средняя высота 1 метр и более. На Зее есть ямы до 12 метров, дно песчано ...

Функции белков
Функции белков в клетке многообразны. Одна из важнейших — строительная функция: белки входят в состав всех клеточных мембран и органоидов клетки, а также внеклеточных структур. Для обеспечения жизнедеятельности клетки исключительно важно ...