Метод определения активности лейцинаминопептидазы

Для определения активности лейцинаминопептидазы 90 мкл сыворотки крови смешивали с 10 мкл раствора пуромицина, приготовленного на соответствующем буфере (в случае опытной пробы (I)) и к 10 мкл 20 мМ фосфатного буфера (рН 7,4) (в случае опытной пробы (II) и контрольной пробы). Далее проводили преинкубацию 8 мин при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением в опытные пробы 100 мкл 310 мкМ раствора лей-b-нафтиламина, приготовленного на буфере. Через 30 мин реакцию останавливали прибавлением 40 мкл 10% раствора ТХУ. В контрольные пробы добавляли 100 мкл субстрата. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин. Отбирали 100 мкл надосадочной жидкости, добавляли по 1,5 мл натрий-ацетатного буфера (рН 4,2). Измерение флюоресценции образовавшегося b-нафтиламина проводили на флюориметре ФМЦ-2 при λex=360 нм и λem=420 нм в кювете толщиной 1 см. Активность фермента определяли как разность между опытной пробой (I) и контрольной пробой и выражали в мкмоль b-нафтиламина, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка. Белок определяли методом Лоури. Ремонт мультиварок

Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента. Полученные отличия в значениях между опытной и контрольной группами считали достоверными при р <0,05.


Другие статьи:

Роль нервной системы в приспособительных реакциях
Как показал великий русский физиолог И.П. Павлов, первая и главная роль в уравновешивании организма с окружающей средой, т. е. приспособление к ней, принадлежит нервной системе. Все влияния внешней среды воспринимаются организмом с помощь ...

Уровни организации жизни живых систем
Все живые организмы в природе состоят из одинаковых уровней организации, это общая для всех живых организмов характерная биологическая закономерность. Выделяют следующие уровни организации живых организмов — молекулярный, клеточный, ткане ...

Интерлейкин-4 и гамма-интерферон при хроническом рецидивирующем фурункулезе
Бактериальные инфекции кожи являются важной клинической проблемой ввиду их распространенности во всем мире и недостаточной эффективности терапии этих заболеваний. ХРФ – множественное и рецидивирующее появление фурункулов, острое гнойно-н ...