Метод определения активности лейцинаминопептидазы

Для определения активности лейцинаминопептидазы 90 мкл сыворотки крови смешивали с 10 мкл раствора пуромицина, приготовленного на соответствующем буфере (в случае опытной пробы (I)) и к 10 мкл 20 мМ фосфатного буфера (рН 7,4) (в случае опытной пробы (II) и контрольной пробы). Далее проводили преинкубацию 8 мин при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением в опытные пробы 100 мкл 310 мкМ раствора лей-b-нафтиламина, приготовленного на буфере. Через 30 мин реакцию останавливали прибавлением 40 мкл 10% раствора ТХУ. В контрольные пробы добавляли 100 мкл субстрата. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин. Отбирали 100 мкл надосадочной жидкости, добавляли по 1,5 мл натрий-ацетатного буфера (рН 4,2). Измерение флюоресценции образовавшегося b-нафтиламина проводили на флюориметре ФМЦ-2 при λex=360 нм и λem=420 нм в кювете толщиной 1 см. Активность фермента определяли как разность между опытной пробой (I) и контрольной пробой и выражали в мкмоль b-нафтиламина, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка. Белок определяли методом Лоури.

Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента. Полученные отличия в значениях между опытной и контрольной группами считали достоверными при р <0,05.


Другие статьи:

Паразиты животных и человека
ПАРАЗИТИЗМ, форма взаимоотношений между организмами различных видов, из которых один (паразит) использует другого (хозяина) в качестве среды обитания и источника питания, нанося ему вред. Паразитизм известен на всех уровнях организации жи ...

Биологические аспекты раннего онтогенеза черношейной поганки и озерной чайки
Уменьшение массы яиц в процессе инкубации. Уменьшение массы яиц в процессе инкубации изучалось у сизой чайки (Беликов, 1974), деревенской ласточки (Шураков, Петухов, 1978а), береговой ласточки (Маркс, 1981), кукушки (Смогоржевский, Смогор ...

Результаты исследования уровня интерлейкина-4 и гамма-интерферона в сыворотке крови больных с различным уровнем иммуноглобулина Е при хроническом остеомиелите
Характер и специфика иммунологической реактивности при хронических остеомиелитах‚ определяется морфологической деструкцией кости и окружающих мягких тканей в зоне воспаления, приобретающих на определенном этапе воспаления свойства аутоант ...