Метод определения активности лейцинаминопептидазы
Для определения активности лейцинаминопептидазы 90 мкл сыворотки крови смешивали с 10 мкл раствора пуромицина, приготовленного на соответствующем буфере (в случае опытной пробы (I)) и к 10 мкл 20 мМ фосфатного буфера (рН 7,4) (в случае опытной пробы (II) и контрольной пробы). Далее проводили преинкубацию 8 мин при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением в опытные пробы 100 мкл 310 мкМ раствора лей-b-нафтиламина, приготовленного на буфере. Через 30 мин реакцию останавливали прибавлением 40 мкл 10% раствора ТХУ. В контрольные пробы добавляли 100 мкл субстрата. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин. Отбирали 100 мкл надосадочной жидкости, добавляли по 1,5 мл натрий-ацетатного буфера (рН 4,2). Измерение флюоресценции образовавшегося b-нафтиламина проводили на флюориметре ФМЦ-2 при λex=360 нм и λem=420 нм в кювете толщиной 1 см. Активность фермента определяли как разность между опытной пробой (I) и контрольной пробой и выражали в мкмоль b-нафтиламина, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка. Белок определяли методом Лоури.
Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента. Полученные отличия в значениях между опытной и контрольной группами считали достоверными при р <0,05.
Другие статьи:
Место человека в системе животного мира
Общие принципы строения организма человека заложены в период, когда сформировался генетический код и возникла первая клетка, т.е. миллиарды лет назад. В генах человека содержится часть генофонда древних рыб, первых хордовых, беспозвоночны ...
Появление новых мутаций: раковые заболевания
Рак груди представляет собой одно из самых часто встречающихся онкологических заболеваний среди женщин, совокупный риск которого, по современным оценкам, составит к возрасту 85 лет для девочек, родившихся в 1990 г., около 12,6% (иначе гов ...
Марганец
Марганец необходим человеку для нормального роста, поддержания репродуктивной функции, образования соединительной ткани. Он участвует в регуляции углеводного и липидного обмена. Недостаточность марганца проявляется в виде снижения массы т ...