Метод определения активности лейцинаминопептидазы
Для определения активности лейцинаминопептидазы 90 мкл сыворотки крови смешивали с 10 мкл раствора пуромицина, приготовленного на соответствующем буфере (в случае опытной пробы (I)) и к 10 мкл 20 мМ фосфатного буфера (рН 7,4) (в случае опытной пробы (II) и контрольной пробы). Далее проводили преинкубацию 8 мин при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением в опытные пробы 100 мкл 310 мкМ раствора лей-b-нафтиламина, приготовленного на буфере. Через 30 мин реакцию останавливали прибавлением 40 мкл 10% раствора ТХУ. В контрольные пробы добавляли 100 мкл субстрата. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин. Отбирали 100 мкл надосадочной жидкости, добавляли по 1,5 мл натрий-ацетатного буфера (рН 4,2). Измерение флюоресценции образовавшегося b-нафтиламина проводили на флюориметре ФМЦ-2 при λex=360 нм и λem=420 нм в кювете толщиной 1 см. Активность фермента определяли как разность между опытной пробой (I) и контрольной пробой и выражали в мкмоль b-нафтиламина, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка. Белок определяли методом Лоури.
Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента. Полученные отличия в значениях между опытной и контрольной группами считали достоверными при р <0,05.
Другие статьи:
Понятие физической реальности (микромир, макромир, мегамир). Типы
физических взаимодействий
Важнейшее свойство материи - ее структурная и системная организация, которая выражает упорядоченность существования материи в виде огромного разнообразия материальных объектов различных масштабов и уровней, связанных между собой единой си ...
Развитие.
Млекопитающие относятся к амниотам, т. е. у них во время эмбрионального развития образуются зародышевые оболочки — амнион, сероза и аллантоис. Современные млекопитающие (за исключением клоачных — они откладывают яйца) — живородящие. Низш ...
Мейоз.
Термином «мейоз» обозначают два следующих друг за другом деления, в результате которых из диплоидных клеток образуются гаплоидные половые клетки – гаметы (рис. 4) Если бы оплодотворение происходило диплоидными гаметами, то плоидность пото ...