Метод определения активности лейцинаминопептидазы

Для определения активности лейцинаминопептидазы 90 мкл сыворотки крови смешивали с 10 мкл раствора пуромицина, приготовленного на соответствующем буфере (в случае опытной пробы (I)) и к 10 мкл 20 мМ фосфатного буфера (рН 7,4) (в случае опытной пробы (II) и контрольной пробы). Далее проводили преинкубацию 8 мин при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением в опытные пробы 100 мкл 310 мкМ раствора лей-b-нафтиламина, приготовленного на буфере. Через 30 мин реакцию останавливали прибавлением 40 мкл 10% раствора ТХУ. В контрольные пробы добавляли 100 мкл субстрата. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин. Отбирали 100 мкл надосадочной жидкости, добавляли по 1,5 мл натрий-ацетатного буфера (рН 4,2). Измерение флюоресценции образовавшегося b-нафтиламина проводили на флюориметре ФМЦ-2 при λex=360 нм и λem=420 нм в кювете толщиной 1 см. Активность фермента определяли как разность между опытной пробой (I) и контрольной пробой и выражали в мкмоль b-нафтиламина, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка. Белок определяли методом Лоури.

Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента. Полученные отличия в значениях между опытной и контрольной группами считали достоверными при р <0,05.


Другие статьи:

Чувство вкуса и вкусовые рецепторы
О вкусе известно гораздо больше, чем об обонянии, и принято считать, что основных вкусов всего четыре: сладкий, соленый, кислый и горький. Но всем богатством оттенков, что называют вкусом, мы обязаны обонянию. Должно быть, многие люди усп ...

Связь синергетики с другими науками
Процессы самоорганизации, которые изучает синергетика, основываются на одном общем эффекте – способности разнокачественных единиц материи в известных условиях проявлять активность, и даже не просто активность, а своего рода двойственность ...

Сине-зеленые водоросли. Общая характеристика (строение, питание, размножение). Распространение и хозяйственное значение
Сине-зеленые водоросли примитивны по своей организации. Их трудно связать с каким-либо другим отделом водорослей. Они в основном являются одноклеточными организмами, обычно соединяющимися в колонии. У некоторых клетки соединены в ценобии, ...